İçindekiler
Spektrofotometri, bir ışık demeti numune çözeltisinden geçerken ışığın yoğunluğunu ölçerek bir kimyasal maddenin ışığı ne kadar emdiğini ölçmek için kullanılan bir yöntemdir. Temel ilke, her bileşiğin belirli bir dalga boyu aralığında ışığı emmesi veya iletmesidir.
Bu ölçüm, bilinen bir kimyasal maddenin miktarını ölçmek için de kullanılabilir. Spektrofotometre kimya, fizik, biyokimya, kimya mühendisliği ve klinik uygulamalar gibi çeşitli alanlarda kantitatif analizin ne kullanışlı yöntemlerinden biridir.
Ölçülen değişken aslında çoğunlukla ışığın yoğunluk derecesidir. Ancak bu aşamada polarizasyon (dalganın hareket yönüne dik gelen düzlemdeki salınımların yönü) durumu da karşımıza çıkabilir.
Bağımsız değişken ise genel olarak ışığın dalga boyutu veya dalga boyu ile karşılıklı bir ilişkisi olan elektron volt veya santimetre gibi foton enerjisi ile doğru orantılı gösteren bir birimdir.
Spektroskopi de spektral çizgilerin üretebilmek ve bunların yoğunluklarını ve dalga boylarını ölçmek için bir spektrometre kullanır. Spektrometreler ayrıca x ışınları ve gama ışınlarından uzak, kızıl ötesine kadar uzanan geniş ve optik olmayan dalga boylarının aralığında çalışabilirler.
Spektrum göreceli birimlerin yerine mutlak olan birimler aracılığı ile ölçmek üzere tasarlanmıştır. Bu cihaz ise genellikle spektrofotometre olarak adlandırılır. Spektrofotometrelerin büyük bir çoğunluğu spektrum yakınındaki spektral bölgelerde kullanılır.
Genel olarak kullanılan herhangi bir özel alet, spektrumun faklı kısımlarını ölçebilmek amacıyla kullanılan farklı teknikler sebebiyle söz konusu toplam aralığın çok küçük bir kısmı üzerinde çalışacaktır.
Mikrodalga ve radyo frekansları gibi optik frekansların altında kalan ışınlar için spektrum analizörü (spektrofotometre) son derece kullanışlı bir cihazdır.
Spektrofotometre son derece kullanışlı bir cihaz olduğundan geniş kullanım alanlarına sahiptirler. Örnek olarak astronomi alanında astronomik nesnelerden gelen radyasyonu analiz etmek ve kimyasal bileşimi ortaya çıkarmak için kullanıldıklarını gösterebiliriz.
Spektrometre, ışığı uzakta bulunan nesneden bir spektruma yayabilmek amacıyla bir ızgara veya prizma kullanır. Bu işlem, gökbilimcilerin kimyasal yapıdaki birçok elementi karakteristik spektral parmak izleri ile tespit etmelerine yardımcı olur.
Nesnenin kendi kendine parlaması durumunda parlayan gazın neden olduğu spektral çizgileri gösterdiğini düşünebiliriz. Söz konusu bu çizgiler beta, gama ve hidrojen alfa çizgileri gibi oluşumlarına neden olan öğeler için adlandırılırlar.
Bu kimyasal bileşikleri ayrıca absorbsiyonla da tanımlayabiliriz. Söz konusu kimyasal bileşikler, diğer nesnelerin yansıttığı ışık gaz bulutundan geçerken emilen enerjilerin eden olduğu, spektrumdaki belirli yerlerde yer alan karanlık bantlar olarak gösterilebilir. Evren ile alakalı kimyasal yapı hakkındaki bilgilerimizin büyük bir çoğunluğu da spektrumlardan geliyor.
Spektrofotometre‘nin Çalışma Prensibi
Tungsten lambadan veya güneş ışığından saçılan ışıkları bizim gözlerimizin beyaz olarak tanımlar. Bu ışıkları farklı dalga boyutlarında meydana gelen ışık enerjilerinin bir karışımı olarak gösterebiliriz. Tipik olarak insan gözleri 380 – 750 nm arasındaki dalga boyutlarına sahip olan ışık enerjilerine cevap verebilir.
- <380 nm dalga boyutunda olan ışıklar Ultraviyole (Mor-ötesi)
- 380-440 nm dalga boyutunda olan ışıklar Menekşe
- 440-500 nm dalga boyutunda olan ışıklar Mavi
- 500-580 nm dalga boyutunda olan ışıklar Yeşil
- 580-600 nm dalga boyutunda olan ışıklar Sarı
- 600-620 nm dalga boyutunda olan ışıklar Turunca
- 620-750 nm dalga boyutunda olan ışıklar Kırmızı
- >750 nm dalga boyutunda olan ışıklar İnfraruj (Kırmızı-ötesi) olarak tanımlanır.
Herhangi bir madde elektromagnetik dalga spektrumunda 380-750 nm uzunluğunda olan görünür ışınların tamamını yansıtıyor veya geçiriyorsa beyaz olarak görünür. Ancak eğer hepsini soğuruyorsa (arbsorbluyorsa) siyah renkte görünür.
Görünebilen spektrumda mavi rengini soğurabilen maddeler sarı renk olarak görünür. Sarı rengi soğuran maddeler ise mavi renk görünür. Yeşil rengi soğuran maddeler kırmızı renkli, kırmızı rengi soğuran maddeler ise yeşil renkli görünür.
Maddelerin görünür rengi ile madde tarafından absorbe edilen renkler, tamamlayıcı renkler olarak adlandırılır. İçerisinde organik molekülleri barındıran bir çözeltiden UV ışınları geçebilirse çözelti söz konusu bu ışınların bir kısmını seçimli olarak soğurur. Diğer ışınları ise çok az soğurur veya olduğu gibi geçirir (transmisyon).
Spektrofotometre’nin Kullanım Amacı
Spektrofotometre moleküler biyoloji alanında oldukça sık kullanılan bir tür fotometredir. Bunun en önemli nedeni içeriğinde yer alan maddenin miktarının bulunmasını sağlamaktır.
Spektrofotometre’nin temel mantığı, hazırlanan çözeltiden belirli spektrumlarda ışın geçirilmesi ve bu ışığın ne kadarının çözelti tarafından soğurulduğunun bulunabilmesi esasına dayanır. Bu anlamda çözeltinin içerdiği madde miktarı ne kadar fazla ise ışın çözelti tarafından o kadar soğurulur.
Spektrofotometre, çözelti maddesinin içinden geçebilen yani çözelti tarafından absorblanmayan ışığın yoğunluğunu tespit eder. Sonrasında ise çözeltinin içeriğindeki aranan maddelerin miktarları hakkında bize bilgi verir.
Bu anlamda daha açıklayıcı bir örnek vermek gerekirse, farklı sıcaklıklarda bakterilerin gelişiminin gösterilmesi değerlendirebilir. Bunun için çeşitli ortamlara bırakılan bakterilerin daha sonrasında çözeltiler içinde teker teker spektrofotometre ile ölçülmesi halinde bakterilerin daha fazla olduğu örnekte çok daha fazla absorblanma gözlenir.
Dolayısıyla bu işlem de bize ortamdaki sıcaklık oranına bağlı olarak bakterilerin büyüme hızları ile ilgili bilgi verir. Sonuç olarak daha fazla bakteri her zaman daha fazla madde demektir. Bu da absorbsiyonun daha fazla olduğu anlamına gelir.
Spektrofotometre’nin Kullanım Alanları
Spektrofotometre cihazının ışık kaynağının türüne göre yapılabilen ölçümler farklı olabilmesi ile birlikte ölçümü yapılabilen madde sayısı da oldukça fazladır. Bu anlamda ölçülen madde sıvı veya gaz yapıda olabilir.
Işık geçirgenliğine sahip olan katı maddelerde de ölçüm yapılması mümkündür. Buna en iyi örnek ise optisyenlik alanıdır. Kullanım alanı son derece geniş olan spektrofotometre’nin kullanım alanlarını aşağıdaki şekilde sıralayabiliriz.
- Tıp: Genel olarak biyokimya alanında vücut sıvılarının içerisinde bulunan çeşitli parametrelerin miktarlarını ölçebilmek için kullanılır.
- Çevre Mühendisliği ve Su Ürünleri: Su ve havada bulunan kirlilik dereceleri ve miktarları spektrofotometre ile ölçülebilmektedir.
- Kimya: Farklı özelliklerdeki bileşik ve karışımların sahip oldukları element yoğunluklarının ve oranlarının saptanmasında kullanılırlar.
- Ziraat: Birtakım toprak analizleri bu alanda spektorfotometreler sayesinde yapılabilir.
- Jeoloji: Madenlerin içerisinde bulunan birçok analizin yapılabilmesi için kullanılabilirler.
Yukarıda sıralanan bilim dallarına ek olarak ilaç sektörü, inşaat, gıda sanayi, biyoloji ve endüstrinin farklı birçok kolunda spektrofotometre ve benzeri cihazlar ile analizler yapılabilir.
Spektrofotometre Hangi Analizlerde Kullanılır?
Spektorfotometreler ultraviyole ve görünür ışıkların (UV-Vis) moleküllerindeki elektronik geçişlerin verdiği spektrum ölçülerini konu alır. Bu aşamada olay, bir ışın demetinin bir maddeden geçtikten veya bir yüzeyden yansıtıldıktan sonraki azalmasının ölçülebilmesi şeklindedir.
Işığın şiddetinin yüzeyden geçtikten sonra azalması absorblamanın arttığının gösterir. Böylece de ölçülen maddelerin konsantrasyonu belirli bir dalga boyutuna sahip olan absorbsiyonu ölçerek bulunur.
Bu yöntemle elde edilen ölçümler, çözeltideki moleküller, inorganik iyon ve komplekslerin analizlerinde kullanılabilir. Genel olarak çoğu molekül, UV veya Vis dalga boylarının absorblar, farklı moleküller ve dalga boylarına karşı absorbans gösterirler.
